Los 3 pasos secuenciales principales de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Los siguientes puntos resaltan los tres pasos secuenciales principales de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los pasos secuenciales son: Desnaturalización 2. Recocido 3. Extensión del ADN.
Paso secuencial # 1. Desnaturalización:
El primer paso es desnaturalizar el ADN (tanto el ADN del cebador como el ADN nativo). La separación de dos cadenas de ADN se conoce como desnaturalización, mientras que la unión de dos soportes se denomina recocido o hibridación (Fig. 48.1). El descubrimiento de la desnaturalización y el recocido del ADN fue hecho artificialmente por Marmor y Lane (1960).
Según ellos, el ADN de doble cadena se podría separar en dos cadenas individuales separadas (desnaturalización) calentando a una temperatura alta (90-95 ° C) y la hibridación o unión de dos cadenas de ADN (ADN de doble cadena) que es posible por Disminuyendo la temperatura (50-56 ° C).
Este es el principio fundamental sobre el que funciona la PCR. El segundo principio es la extensión del cebador con la ayuda de la enzima ADN polimerasa.
El ADN nativo, el cebador y la enzima ADN polimerasa (etiqueta polimerasa) se agregan en un tubo de PCR y la temperatura se eleva y baja en la máquina de PCR para desnaturalizar e hibridar.
Paso secuencial # 2. Recocido:
Después de desnaturalizar el ADN, el siguiente paso es permitir que el cebador de síntesis se reasiente a las cadenas de ADN opuestas de la secuencia diana deseada. El recocido (hibridación) puede ocurrir si la temperatura de 95 ° C se reduce a 50/56 ° C. Luego se baja la temperatura en la máquina.
Tan pronto como la temperatura baje, las cadenas de ADN nativas se unirán no solo entre sí, sino que también se unirán a los cebadores. Esta hibridación específica, o "recombinación" de nucleótidos complementarios, proporciona tanto el fundamento como la base práctica de gran parte del ADN recombinante (Fig. 48.2).
Paso secuencial # 3. Extensión del ADN (se necesita la enzima Taq polimerasa):
Después de que los cebadores se hayan recocido, deben extenderse utilizando el cebador oligonucleótido como punto de inicio. describieron que la enzima ADN polimerasa es necesaria para la síntesis de ADN. Por lo tanto, para la extensión del cebador necesitamos una ADN polimerasa termoestable para que la enzima no se destruya a altas temperaturas.
La polimerasa termoestable (Taq polimerasa) se aísla de Thermus aquaticus. La Taq polimerasa tiene una ventaja tremenda en la realización de la reacción de PCR. Tiene una temperatura de actividad óptima de alrededor de 70 ° C y no se debe agregar enzima nueva a cada tubo de ensayo después del proceso de calentamiento y enfriamiento.
La ADN polimerasa termoestable ahora es fabricada por diferentes compañías con diferentes fuentes (además de Thermus aquaticus) con diferentes nombres comerciales (TM). Para la extensión del cebador, la ADN polimerasa termoestable se agrega en el tubo y la temperatura se eleva a 65-70 ° C.
Los ciclos subsiguientes de separación de cadenas (desnaturalización), hibridación de cebadores (recocido) y síntesis de cadenas (extensión) aseguran la amplificación exponencial de las secuencias diana utilizando la secuencia amplificada si el ciclo anterior es una nueva plantilla, hay tres ciclos (Fig. 48.2 ).
Elaboración de imprimaciones:
Los cebadores son de secuencia corta (a menudo ARN) se utilizan para formar dos nucleótidos, referidos al cebador, con uno para cada extremo del fragmento de ADN y proporciona un extremo libre de 3 -OH en el que una ADN polimerasa inicia la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótido.
Una secuencia se hace en la dirección de los sentidos, mientras que la otra se hace en la dirección de los sentidos. (Fig. 48.2). El cebador se utiliza para cebar la síntesis de cadenas de ADN complementarias y se diseña de tal manera que el ADN entre los cebadores es el fragmento de interés que se amplificará.
Si el ARN mensajero (ARNm) se amplifica, debe convertirse en ADN complementario (ADNc) mediante una ADN polimerasa dependiente de ARN, la transcriptasa inversa. El complejo de cDNA luego se transforma en ADN de doble cadena, convirtiéndose en un molde para una reacción de PCR posterior.
Esto se conoce a menudo como reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT PCR). Los cebadores pueden generarse artificialmente o pueden comprarse a las empresas.
Una vez completada la reacción, los productos amplificados (ADN) se pueden visualizar por electroforesis en gel. La propiedad física importante de la molécula de ADN es que cada nucleótido individual posee una carga neta negativa que resulta del grupo fosfato.
Por lo tanto, los fragmentos de diferentes tamaños expuestos a un campo eléctrico tienden a migrar hacia el electrodo positivo a una velocidad diferente dependiendo del tamaño, con pequeños fragmentos que migran más rápido que el más grande. Este proceso de separación basado en la carga eléctrica se llama electroforesis.
Las muestras de ADN, después de ser digeridas en fragmentos de diferentes tamaños por una enzima de restricción (endonucleasa), se agregan a un medio de soporte tal como gel de agrosa o acrilamida. Los poros del gel dependen de su porcentaje y pueden compararse con un tamiz (molecular). Por lo tanto, la velocidad de migración de los fragmentos de ADN a través del gel depende tanto del tamaño del fragmento de ADN como del voltaje aplicado.
El procedimiento para separar y deducir un fragmento de ADN específico es Southern blotting. La importancia de esta técnica es que el fragmento de una sola hebra puede transferirse por acción capilar a un medio de soporte sólido (membrana de Nylon o celulosa) y fijarse permanentemente por calentamiento (Fig. 48.3).
Después de la electroforesis, el patrón de ADN se puede visualizar bajo una lámpara UV después de tratar con tinción con bromuro de etidio; El bromuro de etidio es un tinte fluorescente. La electroforesis en gel de Agrose distinguió fragmentos de 100 pares de bases a 60000 pares de bases (60 kb), mientras que los geles de poliacrilamida separan efectivamente los fragmentos de 1000 pares de bases (1 kb).
La electroforesis en gel de pulso (PFGE) ha hecho posible la separación de fragmentos de ADN incluso hasta 2kb. En este procedimiento, el campo eléctrico se altera en diferentes direcciones obligando a las moléculas de ADN a reorientar entre cada pulso o corriente eléctrica. Esta es la mejor técnica para identificar un gen conocido.
Las endonucleasas pueden reconocer 3, 4, 5, 6 u 8 pares de bases y están disponibles en el mercado.
Tampones / sales de PCR.
Para la ADN polimerasa Taq, el tampón se fabrica de la siguiente manera:
50 mM KCI
Tris-HCI 10 mM a temperatura ambiente
El dimetilsulfóxido (DMSO) y el glicol se utilizan como co-solvente en los tampones de PCR cuando el objetivo tiene una temperatura de desnaturalización muy alta.
El trifosfato de desoxinucleótido (dNTP) es cofactores de iones.
Ahora las empresas de biotecnología están proporcionando soluciones preparadas.
El principio básico se describe a continuación:
Existen cuatro dNTP, a saber, dATP (trifosfato de adenina), dCTP (citosina), dGTP (gunina), dUTP (uracilo) que se utilizan de acuerdo con las reglas del par de bases para extender el cebador y, en última instancia, para copiar la secuencia objetivo.
El dNTP se une con Mg 2+ . La cantidad de dNTPs presente en una reacción determinará la cantidad de Mg2 + libre disponible para la actividad enzimática óptima. Las soluciones de stock de dNTP deben neutralizarse con Tris base a pH 7.0 y su concentración debe determinarse espectrofotométricamente.
Substrato y análogos de sustrato:
La polimerasa Taq funciona (dNTP) de manera muy efectiva. Sin embargo, hay algunos sustratos modificados disponibles en lugar del sustrato de ADN polimerasa Tag. Son dogoxigenina-dNTP, biotina-11-dUTP, C7deaza-dGTP y dNTPS marcados con fluorescencia.
Los siguientes tipos de PCR son de uso general:
(1) PCR anidada;
(2) RT-PCR;
(3) PCR de anclaje;
(4) PCR asimétrica;
(5) PCR inversa;
(6) DOP-PCR.
