Experimento para cultivar y enumerar un bacteriófago
¡Experimenta para cultivar y enumerar un bacteriófago!
Principio:
Una suspensión de bacterias, susceptible a un bacteriófago (virus que infecta a las bacterias) se siembra con ese bacteriófago y se deja crecer como un césped confluente en una placa de agar.
Las partículas de bacteriófagos crecen dentro de las células bacterianas y las lisan. La lisis de las células bacterianas da como resultado la formación de zonas claras en el césped confluente de bacterias. Estas zonas claras se llaman "placas". Se supone que cada zona clara está formada por una sola partícula de bacteriófago. Por lo tanto, el número de unidades formadoras de placa (PFU) representa el número del bacteriófago.
La técnica de dilución en serie se utiliza en la enumeración de bacteriófagos similar a la utilizada en la enumeración de bacterias. El número de partículas de fago contenidas en una muestra se determina contando el número de placas formadas en la placa de agar sembrada y multiplicándola por el factor de dilución.
Para determinar un recuento de fagos válido, el número de placas por placa no debe exceder de 300 ni ser inferior a 30. Las placas que muestran más de 300 PFU se denominan "demasiado numerosas como para contarlas" (TNTC), mientras que las placas que muestran menos de 30 PFU se denominan 'muy pocos para contar' (TFTC).
Materiales necesarios:
Caldo de triptona, agar triptona suave, agar de triptonona dura, matraz cónico, tubos de ensayo, placas de petri esterilizadas, tapones de algodón, cultivo de reserva de bacteriófagos (ex: colifa T 2 ), caldo nutriente de las bacterias (por ejemplo: Escherichia coli B) Pipetas esterilizadas, autoclave, baño de agua caliente, mechero Bunsen, cámara de flujo laminar, depósito de residuos, incubadora.
Procedimiento:
1. Quince pipetas (en una caja de pipetas de acero inoxidable) y cinco placas de Petri se esterilizan en un horno de aire caliente a 180 ° C durante 3 horas. Alternativamente, se pueden cubrir con papel para manualidades, atar con hilo o banda de goma y esterilizar en un autoclave junto con el medio (Figura 8.3).
2. Los ingredientes del medio de caldo de triptona o su polvo preparado, requerido para 100 ml del caldo se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml agitando y agitando. Su pH se ajusta a 7.5 utilizando HCl 0.1N o NaOH 0.1N según se requiera. El matraz se calienta, si es necesario, para disolver los ingredientes por completo.
3. El caldo se distribuye en 10 tubos de ensayo (9 ml cada uno), tapados con algodón, cubiertos con papel artesanal y atados con hilo o goma.
4. Los ingredientes del medio de agar suave triptona o su polvo ya preparado, requerido para 100 ml del medio, se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml agitando y agitando. Su pH se ajusta a 7.5 utilizando HCl 0.1N o NaOH 0.1N según se requiera. El matraz se calienta para disolver el agar en el medio completamente.
5. Este medio líquido se distribuye en 5 tubos de ensayo (2 ml cada uno), tapados con algodón, cubiertos con papel artesanal y atados con hilo o banda de goma.
6. Los ingredientes del medio de agar duro tryptone o su polvo ya preparado requerido para 100 ml del medio se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml calentando después de ajustar el pH a 7, 5. El matraz está taponado con algodón, cubierto con papel artesanal y atado con hilo o banda de goma.
7. Los 10 tubos de caldo de triptona, los 5 tubos de agar suave de triptona y el matraz que contiene medio de agar duro de triptona se esterilizan a 121 ° C (15 psi de presión) durante 15 minutos en un autoclave.
8. El medio de agar duro de triptona esterilizado en el matraz cónico se vierte en 5 placas petri esterilizadas de forma aséptica para obtener 5 placas de agar duro de triptona.
9. Un ml del cultivo de reserva del bacteriófago (Ejemplo: colifago T 2 ) se transfiere asépticamente, preferiblemente en una cámara de flujo laminar, a un tubo de caldo de triptona (9 ml) usando una pipeta esterilizada. Esto se convierte en la dilución 10 veces (es decir, 10 -1 ). Esto se diluye asépticamente en serie en los otros nueve tubos de caldo, para obtener una dilución final de 10-10 (Figura 8.4).
10. Los 5 tubos de agar blando de triptonona esterilizados se toman y se calientan en un baño de agua a 100 ° C, para fundir el agar. Los tubos se enfrían y los tubos blandos blandos fundidos se mantienen a 45 ° C.
11. De entre los 10 tubos anteriores que contienen fagos en diferentes concentraciones, se seleccionan cinco tubos (es decir, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 y 10 -9 ). Desde estos tubos, se transfiere asépticamente 1 ml cada uno a los cinco tubos de agar blando de triptona usando pipetas esterilizadas separadas.
12. Dos gotas de cultivo en caldo nutriente de la bacteria (Ejemplo: Escherichia coli B) se transfieren asépticamente, preferiblemente en una cámara de flujo laminar, a cada tubo de agar blando de triptona que contiene el bacteriófago en cinco concentraciones diferentes (10 -5 a 10 -9 ).
13. El contenido de los cinco tubos de agar blando de triptona que contienen el bacteriófago y las bacterias se mezcla rápidamente girando entre las palmas de las manos.
14. El contenido se vierte asépticamente sobre las cinco placas de agar duro de triptona marcadas 10 -5 a 10 -9, formando así una preparación de cultivo de placa de doble capa. Las placas se agitan suavemente y se dejan endurecer.
15. Las placas se incuban en posición invertida a 37 ° C en una incubadora.
Observaciones:
1. Todas las placas se observan para las unidades de formación de placa (PFU) que se desarrollan como zonas claras en el césped de las bacterias.
2. Solo las placas que tienen PFU entre 30 y 300 se consideran para la enumeración de fagos. Se cuenta el número de PFU en cada placa. Las placas que muestran más de 300 PFU se designan como "demasiado numerosas para contar" (TNTC), mientras que las placas que muestran menos de 30 PFU se designan como "muy pocas para contar" (TFTC). Tales platos no son considerados.
3. Sobre la base de las observaciones, el número de bacteriófagos por ml del cultivo de fagos se calcula utilizando la siguiente fórmula.
Nº de fagos / ml = Nº de PFUs X factor de dilución
Por ejemplo, si el número de PFU es 280 en una dilución de 10 -7, entonces el número de fagos en el cultivo de reserva del fago es 280 X 10 7 fago / ml (= 2, 80 X 10 9 fago / ml).
